Распространение гепатита В в мире

По разным данным в мире насчитывается около 400 млн человек, которые являются носителями вируса гепатита В (ГВ). Такая цифра в 10 раз превышает количество инфицированных вирусом иммунодефицита человека [1, 6]. Критерием оценки распространения данного заболевания считают частоту выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (hepatitis B surface antigen – HBsAg) среди здорового населения (табл.1). Примерно 45% всего населения земного шара (Китай, Тайвань, тропическая Африка) проживает в регионах с высоким уровнем ГВ-инфекции, 43% – в регионах со средним уровнем распространения заболевания (Юго-Восточная Азия, Россия, Украина) и 12% – на территориях с низким уровнем (Австралия, Центральная Европа, США, Канада) [1, 3, 12, 13].

Таблица 1. Распространение гепатита В в мире

Характеристика возбудителя вирусного заболевания

Гепатит В – это заболевание, вызванное вирусом гепатита В (ВГВ), который поражает печень, вызывая воспаление, а в дальнейшем – цирроз и рак печени (гепатокарценома). Вирус относится к семейству Hepadnaviridae, рода Orthohepadnavirus. Это сложноорганизованный ДНК-содержащий вирус сферической формы, диаметр которого составляет 40 – 48 нм (в среднем 42 нм). Состоит из двойной фосфолипидной оболочки толщиной 7 нм и нуклеокапсида (ядро), имеющий форму икосаэдра диаметром 28 нм. Структура оболочки представлена поверхностным антигеном (HBsAg), состоящий из нескольких сотен молекул белка, глико- и липопротеидов. В ядре вируса находится ядерный антиген (HBcAg), конечный белок HBeAg и ДНК-полимераза. Геном вируса представляет собой частично двухцепочечную ДНК незамкнутой кольцевой формы. Цепь («-» ДНК) составляет около 3220 пар нуклеотидов, короткий («+» ДНК) – 1700 – 2800. Полноценная “-” ДНК – цепь ковалентно связана с ДНК-полимеразой, которая достраивает плюс-цепь [1, 8, 9, 12, 13].

В последние годы было идентифицировано гены ВГВ, кодирующие синтез соответствующих им белков. Ген, кодирующий синтез поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) состоит из трех частей: pre-Sl, pre-S2 и S; ген, кодирующий синтез основного белка нуклеокапсида (HBcAg) состоит из двух частей: С и pre-С. Фермент ДНК-полимераза (способна функционировать как обратная транскриптаза) кодирует Р-ген. Х-ген несет информацию о Х-белке, который не участвует в репликации вируса, однако способен регулировать процессы гепатоканцерогенеза [12, 13].

Вирус гепатита В высокоустойчив к физическим и химическим факторам. Сохраняет жизнеспособность в сыворотке крови при комнатной температуре в течение 3 месяцев, в сыворотке плазмы – до 25 лет. Резистентный ко многим средствам и консервантам крови. Вирус инактивируется при автоклавировании (45 мин) и стерилизации сухим жаром (160 °С), чувствителен к эфиру и неионных детергентов. Для химической дезинфекции используют в основном альдегиды и соединения хлора [13].

Репликация вируса в организме человека и формирование иммунного ответа

Вирус проникает в клетки печени благодаря наличию на их поверхности специфических рецепторов. После разрушения внешних оболочек высвобождается внутренний компонент, имеющаяся в его составе вирусная ДНК-полимераза достраивает «недостающий» участок «+» цепи ДНК. Инфекция может протекать по одному из двух механизмов: продуктивном и интегративном. В случае продуктивного типа происходит транскрипция ДНК, образование информационной рибонуклеиновой кислоты (и-РНК), синтез вирусных белков. Репликация ДНК происходит по уныкальному механызму с использованием как матрицы не ДНК, а РНК. Цикл репродукции заканчивается сборкой вирусных частиц в цитоплазме гепатоцитов [13]. При интегративной инфекции (хронический тип заболевания) после достройки второй нити ДНК происходит интеграция ДНК с клеточным геномом вблизи сильного промотора. В этом случае клетка начинает в большом количестве производить HBs-антиген. HBsAg синтезируется в цитоплазме гепатоцитов в избытке. Итак, в результате репродукции компонентов ВГВ в сыворотке крови больного человека скапливается именно частицы HBsAg, а не полноценные вирионы. В среднем на одну вирусную часть приходится от 1000 до 1000000 сферических HBsAg. Другая часть молекулы HBsAg представлена в виде трубочек, которые накапливаются в эндоплазматической сети клетки [9, 13].

При заражении ВГВ в организме вырабатываются антитела против трех антигенных детерминант: анти-HBs-антитела к поверхностному антигену, анти-НВс-антитела к ядерному антигену и анти-HBe-антитела к е-антигену [9, 12, 13].

Открытие HBsAg и первые вакцины против гепатита В

Первый зарегистрированный случай эпидемии, вызванной вирусом гепатита B, был описан Лурманом в 1885 [14]. Основным «компонентом» ВГВ является поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), что собственно и вызывает иммунный ответ в организме больного и играет ключевую роль в диагностике и изучении этиологии, патогенеза, клиники и профилактики гепатита В [1, 13]. Этот маркер и антитела к нему были открыты еще в 1965 году Бламбергом при изучении полиморфизма сывороточных белков в австралийских аборигенов, больных гемофилией (именно поэтому одно из названий HBsAg – «австралийский» антиген) [15]. Обнаружена «антиген – антительная система» была ассоциирована с гепатитом, который возник после переливания крови. В1970 г. Дейн при электронной микроскопии сывороток пациентов, больных гепатитом В также обнаружил маленькие частицы диаметром 20 нм, которые впоследствии назвали частицами Дейна [5, 15].

Через восемь лет после открытия HBsAg были предприняты первые попытки получения вакцины против гепатита В. В1971 г. Кругман с соавт. [2] обнаружили, что кровь хронических носителей, прогрета в течение 1 мин на водяной бане, способна защищать от инфекции. Затем было установлено, что у людей, которых вакцинировали данным «препаратом», создавались антитела к вирусному заболеванию [2].

Следующим этапом создания вакцины против гепатита В стал препарат на основе высокоочищенного HBsAg. В качестве источника антигена использовали плазму крови носителей HBsAg. Вследствие этого такие вакцины стали называть «плазменными» вакцинами. В начале 80-х годов ученые из разных стран мира (США, Франция и др.) разработали схемы очистки данного антигена [5]. Подобная «плазменная» вакцина против гепатита В была разработана в России в середине 80-х годов сотрудниками Института вирусологии им. Д.И. Ивановсьокого Российской академии медицинских наук (РАМН) под руководством В.А. Ананева и В.М. Жданова [4]. Такая вакцина прошла определенные испытания, оказалась эффективной и безопасной, однако широко не используется [4, 5].

Отметим, что «плазменными» вакцинами прививали много людей, при этом ни одного случая заражения не было зарегистрировано. Но, учитывая, что в качестве сырья для производства вакцины использовали известный инфекционный материал (кровь больного), существовали определенные опасения, ведь кровь может содержать патогены других заболеваний (например, ВИЧ), что в свою очередь может привести к заражению во время прививок [2, 4, 18]. И хотя такие вакцины все еще применяются в некоторых странах мира (Индонезия, Вьетнам, Иран, Мианма и др.), их использование постепенно прекращается, ведь способы получения вакцины из плазмы крови требуют больших затрат и очень трудоемки [2, 18].

Для лечения хронического гепатита В раньше использовались синтетические аналоги нуклеозидов (видарабин) [5]. Но такие препараты вызывали побочные эффекты (прежде всего, гепатотоксичность), поэтому интерес к ним резко снизился. В конце 80-х годов начали проводить исследования о влиянии на ВГВ интерферонов (человеческий лейкоцитарный интерферон) [5], и результаты показали значительное увеличение иммунокомпетентных клеток к данному вирусу. Современными препаратами для лечения хронического гепатита В является α-интерферон (α-ИФН) и ламивудин (аналог нуклеозидов). Кроме этих препаратов, начинают использовать нуклеозидные аналоги: энтекавир, фамцикловир и адефовир (аналог нуклеотидов), которым присуща высокая противовирусная активность [5].

ДНК-технологии. Создание рекомбинантных вакцин

Определяющим этапом создания вакцины против гепатита В было внедрение ДНК-технологий [10, 11]. Современные генно-инженерные вакцины против гепатита В на основе технологии рекомбинантной ДНК были разработаны в начале 80-х годов и применяются с1985 г. [11]. Данная вакцина относится к субъединичным вакцинам. Основным ее компонентом является поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Преимуществом вакцины есть полное отсутствие продуктов крови в цикле производства, низкое содержание балластных веществ, стабильность, точно измеряемое количество активного компонента, полная безопасность и высокая иммуногенность [8, 10, 11]. Однако в некоторых случаях при иммунизации людей обычной рекомбинантной вакциной против гепатита В, даже после повторной вакцинации, не производятся циркулирующие антитела. Для предотвращения этого были разработаны новейшие технологии. ДНК-вакцины против гепатита В вводили в липосомы, или смешивали с интерлейкином-2. Такие методы позволили преодолеть нежелательный результат у вакцинированных [8].

Для предотвращения заболевания ВГВ существует общая профилактика населения, состоящая из неспецифических и специфических методов [12]. Неспецифические методы зависят в основном от поведения людей в обществе (использование средств защиты при половых отношениях; одноразовые медицинские инструменты для инъекций; переливания крови с соблюдением всех требований и др.). Что касается специфики – это иммунопрофилактика населения, то есть использование рекомбинантных вакцин против гепатита В [12]. Такие вакцины служат и одновременной профилактикой онкологических заболеваний, поскольку вирусное заболевание гепатитом В тесно связано с первичным раком печени. С помощью вакцинации удается снизить заболеваемость гепатитом В в 30 раз [8].

Особенности создания генно-инженерных вакцин

Как рекомбинантные микроорганизмы для получения вакцины против гепатита В используют в основном дрожжи Saccharomyces cerevisiae, Нansenula polymorpha и Pichia pastoris [7, 16-19]. Получение рекомбинантной вакцины включает следующие этапы: с молекулы ДНК вируса гепатита В вырезают ген S, ответственный за синтез поверхностного антигенц вируса гепатита В; этот ген встраивают в плазмиду и вводят ее в клетки дрожжей; в результате дрожжи начинают синтезировать частицы HBsAg; после очистки от балластных белков антиген адсорбируют на гидроксиде алюминия и инактивируют [8, 10, 11, 16, 17, 19]. Обобщающая характеристика технологических особенностей получения поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием различных продуцентов приведена в табл. 2 [16, 17, 19].

Таблица 2. Особенности получения поверхностного антигена вируса гепатита В с помощью P. pastoris PS103 (pHBS), S. cerevisiae №965 (ГКВ) и S. cerevisiae ДАН-041 / р ЕS20