Известно, что на сегодняшний день субклинический гипотиреоз (СГПТ) является наиболее часто встречаемым и наиболее изученным синдромом в эндокринологии. Тем не менее, в диагностике и лечении этого состояния остается много вопросов, не имеющих однозначной трактовки. Поэтому среди ученых разных стран не ослабевает интерес к изучению различных аспектов СГПТ, клинического синдрома, обусловленного стойким дефицитом тиреоидных гормонов (ТГ) в организме. Актуальность проблемы СГПТ в клинической практике врачей различных специальностей обусловлена тем, что при дефиците ТГ, необходимых для нормального функционирования практически каждой клетки, развиваются тяжёлые нарушения во всех без исключения органах и системах [1]. СГПТ обозначается лёгкая недостаточность щитовидной железы (ЩЖ), при которой определяется изолированное повышение уровня тиреотропного гормона гипофиза (ТТГ) при нормальном уровне ТГ в крови [2]. Известно, что ТГ: трийодтиронин (Т3) и тироксин (Т4) играют важную роль в деятельности ряда жизненно важных функций организма, в частности, в регуляции обмена веществ путём стабилизации внутренней среды организма. Многие явления, возникающие как следствие недостатка гормонов ЩЖ, могут быть устранены введением йодидов и ТГ. Исходя из рассмотрения системы нейроэндокринной регуляции клетки, известно, что данную систему помимо ТГ и стероидных гормонов (СГ), составляют также нейромедиаторы (НМ), одним из которых является ацетилхолин (АХ), являющийся одним из эфиров холина (ХЛ) [3]. Известно, что ХЛ (от греч, choly – жёлчь), гидроокись 2-оксиэтилтриметиламмония, [(CH3)3N+CH2CH2OH] OH^-. Бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде, этиловом спирте, нерастворимые в эфире, бензоле. ХЛ легко образует соли с сильными кислотами, его водные растворы обладают свойствами сильных щелочей. ХЛ широко распространён в живых организмах. ХЛ входит в состав фосфолипидов (например, лецитина, сфингомиелина), служит источником метильных групп в синтезе метионина  [4].

В коррекции соматических и нейрогенных нарушений важна роль холиновых эфиров α,  β – дегидроаминокислот (ХЭА), заслуживающих существенного внимания с точки зрения особенностей их синтеза и биологической активности. Согласно результатам исследований [5, 6] ХЭА осуществляется ряд важнейших функций в организме человека и животных. Вместе с тем продолжают отсутствовать сведения относительно применения ХЭА, в частности, использованного в данном исследованнии доз холинового эфира N – (2 – меток­си­бен­зо­ил) – O – изопропил – α, β – дегидротирозина (ХЭ) в изучении возрастных особенностей изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс с СГПТ. В данном научном исследовании, исходя из вышесказанного, осуществлён синтез ХЭ и исследовано его сверхмалых доз (СМД) 10^-13 и 10^-17 М на изменение концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у одно-, трёх- и шестимесячных крыс с СГПТ посредством метода иммуноферментного анализа (ИФА).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 

В Научно-технологическом центре органической и фармацевтической химии Национальной Академии Наук Республики Армении, в лаборатории № 4, под руководством доктора химических наук, профессора Топузяна В. О., осуществлён синтез ХЭ. В Институте физиологии им. Л. А. Орбели, в лаборатории нейроэндокринных взаимоотношений, впервые на крысах разных возрастных групп, исследованы особенности изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс при субклиническом ГПТ до и после воздействия СМД ХЭ посредством высокоспецифичного и чувствительного метода ИФА.

Исследования проведены на 150 крысах-самцах (линии Вистар), разделенных на 3 подопытные группы:

1. Одномесячные крысы – 50 экземпляров, из которых – 5 – интактные животные; 15 – контрольные животные с СГПТ; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М.
2. Трёхмесячные крысы – 50 экземпляров, из которых – 5 – интактные животные; 15 – контрольные животные с СГПТ; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М.
3. Шестимесячные крысы – 50 экземпляров, из которых – 5 – интактные животные; 15 – контрольные животные с СГПТ; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М; 15 – животные с СГПТ, получавшие в течение 2 недель внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М.

СГПТ вызывался путём проведения тиреоидэктомии (ТЭК). ТЭК осуществлялась по следующему алгоритму. До проведения операции крысы под эфирным наркозом фиксировались в положении на спине. Доступ к ЩЖ осуществлялся через разрез кожи в области шеи. Затем обнажалась ЩЖ, производилась отпрепаровка 2/3 её части с сохранением паращитовидных желёз и с помощью острых ножниц доли отсекались, после чего под каждую из них подводились лигатуры. Раны послойно зашивались. Животные хорошо переносили операцию и спустя 0,5 – 1 час после операции подходили к корму и воде. После ТЭК и окончания дачи ХЭ у исследуемых животных всех возрастных групп была проведена декапитация и осуществлён сбор крови. В сыворотке крови с помощью метода ИФА определялась концентрация ТТГ, общего Т3 и общего Т4 посредством иммуноферментного анализатора RISER 8793. Принцип работы набора заключается в том, что определение уровня ТТГ (или ТГ) основано на использовании конкурентного варианта твердофазного ИФА. На внутренней поверхности лунок планшета иммобилизованы машинные моноклональные антитела к ТТГ (или ТГ). В лунке планшета вносят исследуемый образец и конъюгат (Т4, конъюгированный с пероксидазой). Во время инкубации ТТГ (или ТГ) образца конкурирует с конъюгированным ТТГ (или ТГ) за связывание с антителами на поверхности лунки. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски обратно пропорциональна концентрации ТТГ (или ТГ) в исследуемом образце. Концентрацию ТТГ (или ТГ) в исследуемых образцах определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания ТТГ (или ТГ) в калибровочных пробах. Статистическая обработка результатов производилась в среде Statistica 6.0 for Windows по методу ANOVA с post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение полученных результатов до и после воздействия производилось по критерию Вилкоксона для непараметрических данных, разброс данных на рисунках – стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В условиях субклинического ГПТ у крыс всех 3 возрастных групп происходило резкое изменение содержания исследованных гормонов в сыворотке крови. У крыс с СГПТ было отмечено резкое повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови. Что же касается содержания ТГ, то у всех 3 возрастных групп животных оно проявлялось на незначительном уровне. Данные закономерности характерны для этиологии СГПТ.

У одномесячных крыс с СГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 528, 5 % по сравнению с его исходным уровнем (норма, приятая за 100 %). Также происходило незначительное снижение уровней общего Т3 (на 5 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 20 % по сравнению с нормой принятой за 100 %).

У одномесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 116, 7% по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 3, 2 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 5, 9 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 1, пункт 1, А, Б, В).

У одномесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 82, 5% по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 1, 4 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 1, 1  % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 1, пункт 2, А, Б, В).

В следующей серии исследований было проведено изучение изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у трёхмесячных крыс с СГПТ до и после воздействия СМД ХЭ.

У трёхмесячных крыс с СГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 609, 7 % по сравнению с его исходным уровнем (норма, приятая за 100 %). Также происходило незначительное снижение уровней общего Т3 (на 7 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 16, 2 % по сравнению с нормой принятой за 100 %).

У трёхмесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 107, 8 % по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 0, 9 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 1, 3 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 2, пункт 1, А, Б, В).

У трёхмесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 73, 1 % по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 0, 5 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 0, 4 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 2, пункт 2, А, Б, В).

В следующей серии исследований было проведено изучение изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у шестимесячных крыс с СГПТ до и после воздействия СМД ХЭ.

У шестимесячных крыс с СГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 793, 5 % по сравнению с его исходным уровнем (норма, приятая за 100 %). Также происходило незначительное снижение уровней общего Т3 (на 1, 6 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 0, 8 % по сравнению с нормой принятой за 100 %).

У шестимесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-13 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 126, 3 % по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 0, 5 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 1, 1 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 3, пункт 1, А, Б, В).

У шестимесячных крыс с СГПТ, получавших внутримышечные инъекции ХЭ в дозе 10^-17 М, содержание ТТГ резко понижалось и достигало 97, 2 % по сравнению с нормой принятой за 100 %. Аналогичные сдвиги при действии данной дозы ХЭ отмечаются и в повышении содержания общего Т3 (на 2, 3 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) и Т4 (на 1, 4 % по сравнению с нормой принятой за 100 %) в сыворотке крови у крыс с СГПТ (рис. 3, пункт 2, А, Б, В).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящий момент уровень заболеваемости ЩЖ во всём мире растёт [7]. Причиной СГПТ может быть йодная недостаточность, которая существует в Республике Армения. Состояние факторов среды, качество жизни населения и условия его жизнедеятельности остаются низкими [8]. Загрязнение окружающей среды ионами свинца так же оказывает негативное влияние на уровень ТГ [9]. За последние годы во всем мире увеличилась частота тиреоидной недостаточности. Частота увеличилась не только потому, что сохраняется абсолютный дефицит йода во многих странах. Ухудшается экологическая ситуация, что приводит к относительной йодной недостаточности, увеличивается радиационный фон, повышается распространение аутоиммунных заболеваний, в том числе хронического аутоиммунного тиреоидита, возрастает использование антитиреоидных препаратов [10]. 

Анализируя результаты полученных исследований, можно сделать вывод, что при применении ХЭ в СМД 10^-13 М отмечается более слабый протекторный эффект в отношении показателей ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс всех возрастных групп при патологии ЩЖ типа СГПТ. В то же время воздействие ХЭ в СМД 10^-17 М при вышеуказанной патологии ЩЖ, вызывает восстановление показателей ТТГ и ТГ практически до нормы. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об оптимальной эффективности применения СМД 10^-17 М в восстановлении показателей содержания ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс с СГПТ.  Полученные данные имеют, вероятно, важное теоретическое значение для понимания химических механизмов патологии ЩЖ типа субклинического ГПТ. Они существенно восполняют пробелы в области биохимических исследований роли СМД ХЭА, в вопросах функционального восстановления ЩЖ при СГПТ.

Полученные результаты могут быть учтены и в клинической практике, при изучении патологий ЩЖ разной этиологии, прогнозировании течения и исхода функционального восстановления у лиц с данными патологиями. С целью исследования действия ХЭ в одинаковых экспериментальных условиях для возможной оценки природы СГПТ, определяли степень выраженности и идентичность эффекта ХЭ в норме для последующего применения в патологии. Получен результирующий эффект ХЭ, аналогичный таковому при локальной его аппликации, независимо от мишени, с известной разницей в выраженности эффекта, определяемой проницаемостью гематоэнцефалического барьера и локализацией структуры в пределах мозга. Представленный анализ недавних изучений нейропротекторных агентов, антиоксидантов, стволовых клеток, вакцин, различных хирургических техник, позволяют заключить, что нужны новые эффективные средства для лечения патологий ЩЖ типа СГПТ [11]. Несмотря на интенсивные исследования, следует отметить фактическую безуспешность современных достижений при попытках терапии специфических патологий, типа CГПТ, как правило, впоследствии, приводящих к тяжелой инвалидности [12 – 15].

С учётом мультифакторной и мультифазной патофизиологии CГПТ эффективной может стать нейропротекторная стратегия терапии синтетическими аналогами НМ, типа ХЭА, и, в частности ХЭ, как изолированно, так и в сочетании с ферментными препаратами гиалуронидазного действия, исходя из специфики их воздействия [16, 17], а также, вероятно, их комбинированная терапия со СГ при исследовании содержания ТТГ и ТГ в крови. Предлагаемый нами терапевтический подход может содействовать длительному и стабильному воздействию, поскольку различные химические компоненты ХЭ обладают высокой специфической избирательностью и необратимостью эффектов [19 – 22].

Рис. 1. Диаграммы изменения концентрации ТТГ и ТГ в крови у одномесячных крыс в норме (А), при ГПТ (Б) и после действия ХЭ (В) в дозе 10^-13 М [1] и в дозе 10^-17 М [2]. Концентрация ТТГ выражена в мМЕ/мл; Т3 в нг/мл; Т4 в мкг/мл.

Рис. 2. Диаграммы изменения концентрации ТТГ и ТГ в крови у трёхмесячных крыс в норме (А), при ГПТ (Б) и после действия ХЭ (В) в дозе 10^-13 М [1] и в дозе 10^-17 М [2]. Концентрация ТТГ выражена в мМЕ/мл; Т3 в нг/мл; Т4 в мкг/мл.

Рис. 3. Диаграммы изменения концентрации ТТГ и ТГ в крови у шестимесячных крыс в норме (А), при ГПТ (Б) и после действия ХЭ (В) в дозе 10^-13 М [1] и в дозе 10^-17 М [2]. Концентрация ТТГ выражена в мМЕ/мл; Т3 в нг/мл; Т4 в мкг/мл.

Известно, что длина электромагнитных волн бывает самой различной: от значений порядка 103 м (радиоволны) до 10^-8 см (рентгеновские лучи). Свет составляет ничтожную часть ши­рокого спектра электромагнитных волн. Тем не менее, именно при изучении этой малой части спектра были открыты другие излучения с необычными свойствами. Ультрафиолетовое из­лучение (УФИ, УФ-излучение) – невидимое глазом электромагнитное излучение, зани­маю­щее область между нижней границей видимого спектра и верхней границей рентгеновского из­лу­чения. Длина волны УФ-излучения лежит в пределах от 100 до 400 нм (1 нм = 10^-9 м). По классификации Международной комиссии по освещению (CIE) спектр УФ-излучения делится на три диапазона: 1) UV-A – длинноволновое (315 – 400 нм.); 2) UV-B – средневолновое (280 – 315 нм.); 3) UV-C – коротковолновое (100 – 280 нм.) [1]. Высокая химическая активность, невидимо, большая проникающая способность, убивает микро­организмы, в небольших дозах бла­готворно влияет на организм человека (загар), но в больших дозах оказывает отрицательное био­логическое воздействие: изменения в развитии клеток и обмене веществ, действие на глаза. В современном мире УФИ находит самое широкое применение в различных областях. При­ме­не­ние УФИ в медицине связано с тем, что оно обладает бактерицидным, мутагенным, терапевтическим (лечебным), антимикотическими и профилактическими действиями, дезин­фек­ция; лазерная биомедицина. В косметологии УФ-облучение широко применяется в соляриях для получения ровного красивого загара. Дефицит ультрафиолетовых лучей (УФ-лучей) ведёт к ави­таминозу, снижению иммунитета, слабой работе нервной системы, появлению психической не­устойчивости. УФИ оказывает существенное воздействие на фосфорно-кальциевый обмен, сти­мулирует образование витамина D и улучшает все метаболические процессы в организме. Сле­дует подчеркнуть, что использование УФИ как физического фактора воздействия на микро­ор­ганизмы может обеспечить обеззараживание среды обитания в очень высокой степени, например до 99, 9 %. Технология формования полимерных изделий под действием УФИ (фотохимическое формование) находит применение во многих областях техники. В частности, эта технология широко применяется в полиграфии и в производстве печатей и штампов. Также УФ-излучение используется в криминалистике. Учёные разработали технологию, поз­во­ляю­щую обнаруживать малейшие дозы взрывчатых веществ. В приборе для обнаружения сле­дов взрыв­чатых веществ используется тончайшая нить (она в две тысячи раз тоньше че­ло­ве­чес­кого во­лоса), которая светится под воздействием УФИ, но всякий контакт со взрывчаткой: три­нитро­то­луолом или иными используемыми в бомбах взрывчатыми веществами, прекращает её све­че­ние. Прибор определяет наличие взрывчатых веществ в воздухе, в воде, на ткани и на коже по­доз­реваемых в преступлении. Также УФ-излучение используется в современном шоу-бизнесе в осуществлении освещения и постановке световых эффектов [2]. Ультрафиолет (УФ) излучается всеми твёрдыми телами, у которых t >1000 ^о С, а также светящимися парами ртути. Ос­новными источниками УФ-излучения являются: звёзды (в т. ч. Солнце); лазерные установки; газо­разрядные лампы с трубками из кварца (кварцевые лампы), ртутные; ртутные выпрямители [3].

Известно, что УФ-излучение оказывает на человека 2 типа воздействия: позитивное и негативное. В солнечном свете 40 % спектра составляет видимый свет, 50 % – инфракрасное излучение и 10 % – УФ. Общеизвестно, что именно УФ-лучи инициируют процесс образования витамина D, который необходим для усвоения организмом кальция и обеспечения нормального развития костного скелета. Кроме того, ультрафиолет активно влияет на синтез гормонов, отвечающих за суточный биологический ритм. Исследования показали, что при облучении УФ-лучами сыворотки крови в ней на 7 % увеличивалось содержание серотонина – «гормона бодрости», участвующего в регуляции эмоционального состояния. Также серотонин является нейромедиатором (НМ) возбуждающего действия. Его дефицит может приводить к депрессии, колебаниям настроения. При этом количество мелатонина, обладающего тормозящим действием на эндокринную (ЭC) и центральную нервную (ЦНС) системы, снижалось на 28 % [4]. Ещё один аспект позитивного влияния УФ-лучей на организм – их бактерицидная функция. Негативное влияние УФ-лучей обусловлено тем, что существует ряд эффектов, возникающих при воздействии УФ-излучения на организм человека, которые могут приводить к ряду серьёзных структурных и функциональных повреждений. Как известно, эти повреждения можно разделить на: 1) вызванные большой дозой облучения, полученной за короткое время (например, солнечный ожог). Они происходят преимущественно за счёт лучей UV-B, энергия которых многократно превосходит энергию лучей UV-A и 2) вызванные длительным облучением умеренными дозами. Они возникают преимущественно за счёт лучей спектра UV-A, которые несут меньшую энергию, но способны глубже проникать в кожу, и их интенсивность мало меняется в течение дня и практически не зависит от времени года. Так как коротковолновый ультрафиолет (УФ) из-за эффективного поглощения озоном атмосферы поверхности земли не достигает, то биологически активным является УФ-свет с длиной волны более 290 нм. Уменьшение озонового слоя атмосферы над некоторыми широтами представляет большую опасность для организмов. Наиболее разрушительный эффект, в том числе с летальным исходом, оказывают фотоны UV-B и UV-C излучения, действующие на биологические объекты на всех уровнях их организации от молекулярного до экосистемного [5]. Жёсткое УФИ могло быть именно тем фактором, который заставил первые органические молекулы соединяться вместе для создания рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая считается основой жизни. Но, не будь озонного слоя, все живое на земле исчезло бы под действием солнечной радиации, в состав которой входит и УФИ [6].

На сегодняшний день гипотиреоз (ГПТ) является наиболее часто встречаемым и наиболее изученным синдромом в ЭС [7]. Тем не менее, в диагностике и лечении этого состояния остаётся много вопросов, не имеющих однозначной трактовки. Поэтому среди учёных разных стран не ослабевает интерес к изучению различных аспектов ГПТ, клинического синдрома, обусловленного стойким дефицитом тиреоидных гормонов (ТГ) в организме [8]. Актуальность проблемы ГПТ в клинической практике врачей различных специальностей обусловлена тем, что при дефиците ТГ, необходимых для нормального функционирования практически каждой клетки, развиваются тяжёлые нарушения во всех без исключения органах и системах. ГПТ подразделяется на первичный, вторичный и третичный. Наиболее часто встречается первичный ГПТ, развивающийся вследствие разрушения (удаления) щитовидной железы (ЩЖ) [9]. Основными причинами приобретённого первичного ГПТ являются хронический аутоиммунный тиреоидит, оперативные вмешательства на ЩЖ, терапия радиоактивным йодом ¹³¹I по поводу различных форм зоба [10].

По степени тяжести ГПТ классифицируется на субклинический, манифестный и осложнённый [12]. Cубклиническим ГПТ (СГПТ) обозначается лёгкая недостаточность ЩЖ, при которой определяется изолированное повышение уровня тиреотропного гормона гипофиза (ТТГ) при нормальном уровне общих и свободных ТГ в крови [13]. Под манифестным ГПТ (МГПТ) подразумевается недостаточность функции ЩЖ, при которой выявляется повышенный уровень ТТГ и снижение уровня общих и свободных ТГ. Об осложнённом ГПТ (ОГПТ) говорят в ситуации, когда ГПТ привёл к тяжёлым соматическим или неврологическим расстройствам, таким как кретинизм, сердечная недостаточность, полисерозит, микседематозная кома и др. В настоящее время такие состояния практически не встречаются, поэтому многие авторы выделяют лишь СГПТ и МГПТ [14].

Известно, что ТГ трийодтиронин (Т3) и тироксин (Т4) играют важную роль в деятельности ряда жизненно важных функций организма, в частности, в регуляции обмена веществ путём стабилизации внутренней среды организма. Многие явления, возникающие как следствие недостатка гормонов ЩЖ, могут быть устранены введением йодидов и ТГ [15].

Исходя из рассмотрения системы нейроэндокринной регуляции клетки, известно, что дан­ную систему помимо ТГ и стероидных гормонов, составляют также НМ, одним из которых яв­ляется возбуждающий НМ ацетилхолин, являющийся одним из эфиров холина [16].

Известно, что холин (от греч, choly – жёлчь), гидроокись 2-оксиэтилтриметиламмония, [(CH3)3N+CH2CH2OH] OH^-. Бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде, этиловом спирте, нерастворимые в эфире, бензоле. Холин легко образует соли с сильными кислотами, его вод­ные растворы обладают свойствами сильных щелочей. Холин широко распространён в жи­вых организмах. Холин входит в состав фосфолипидов (например, лецитина, сфинго­мие­ли­на), служит источником метильных групп в синтезе метионина [17]. В коррекции соматических и ней­рогенных нарушений важна роль холиновых эфиров N-замещённых-α, β-дегидро­амино­кис­лот (ХЭА), заслуживающих существенного внимания с точки зрения особенностей их синтеза и био­логической активности [18].

Согласно результатам исследований [19] эфирами и амидами холина натурального и синтетического происхождения осуществляется ряд важнейших функций в организме человека и животных. Вместе с тем продолжают отсутствовать сведения относительно применения сверхмалых доз (СМД) ХЭА, в частности, холинового эфира N-(2-метокибензоил)-О-изопропил-α, β-дегидротирозина (ХЭД1) и холинового эфира N-(2-метокибензоил)-О-метил-α, β – дегидротирозина (ХЭД2), синтезированных в Научно-технологическом центре органической и фармацевтической химии Национальной Академии наук Республики Армении под руководством доктора химических наук, профессора Топузяна В. О., в изучении особенностей изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс при патологии ЩЖ млекопитающих типа МГПТ.

В данном научном исследовании, исходя из вышесказанного, исследовано действие СМД ХЭД1 и ХЭД2 (10^-13 – 10^-17 М), подвергнутых действию УФИ, на изменение концентрации ТТГ, Т3, Т4, в сыворотке крови у крыс посредством метода иммуноферментного анализа (ИФА). 

Методы 

При изучении кратковременного действия УФИ на ХЭД1 и ХЭД2, использовался прибор RIDDER-2A, производства Китайской Народной Республики, снабжённый ртутно-кварцевой лампой ODRA-1 со сплошным спектром излучения (220 – 700 нм). Расстояние от лампы до объекта составляло 60 см, доза излучения 2, 5 * 10⁶ Дж*м^-2, определялась уфиметром LERD-3i (China).

Исследования проведены на 310 двенадцатимесячных крысах-самцах (линии Вистар, массой 200 – 250 г). МГПТ вызывался путём проведения тиреоидэктомии (ТЭК). ТЭК осуществлялась по следующему алгоритму. До проведения операции крысы под эфирным наркозом фиксировались в положении на спине. Доступ к ЩЖ осуществлялся через разрез кожи в области шеи длиной около 3,5 – 4 см. Затем обнажалась ЩЖ, производилась отпрепаровка 2/3 её части с сохранением паращитовидных желёз и с помощью острых ножниц доли отсекались, после чего под каждую из них подводились лигатуры. Раны послойно зашивались. Животные хорошо переносили операцию и спустя 0,5 – 1 час после операции подходили к корму и воде. После ТЭК и окончания 14 дневных внутримышечных инъекций СМД ХЭД1 и ХЭД2 подвергнутых УФИ, у исследуемых животных была проведена декапитация и осуществлён сбор крови.

Животные были разделены на следующие 6 подопытных групп:

1. Интактные животные – 60 шт.
2. Контрольные животные с МГПТ, вызванным ТЭК – 50 шт.
3. Крысы с МГПТ, вызванным ТЭК, получавшие СМД ХЭД1 в диапазоне 10^-13 М – 50 шт.
4. Крысы с МГПТ, вызванным ТЭК, получавшие СМД ХЭД1 в диапазоне 10^-17 М – 50 шт.
5. Крысы с МГПТ, вызванным ТЭК, получавшие СМД ХЭД2 в диапазоне 10^-13 М – 50 шт.
6. Крысы с МГПТ, вызванным ТЭК, получавшие СМД ХЭД1 в диапазоне 10^-17 М – 50 шт.

В сыворотке с помощью метода ИФА определялась концентрация ТТГ, общего Т3 и общего Т4 посредством иммуноферментного анализатора RISER 8793 (China), разработанного для качественной или количественной оценки результатов ИФА и используемого в медицине, биологии, фармакологии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и ветеринарии и в службах санэпиднадзора. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при определённой длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности. ИФА по сравнению с другими методами выявления антигенов и антител обладает следующим преимуществом: высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл [20]. В данных сериях исследований принцип работы набора заключался в том, что определение уровня ТТГ (или ТГ) основано на использовании конкурентного варианта твердофазного ИФА. На внутренней поверхности лунок планшета иммобилизованы машинные моноклональные антитела к ТТГ (или ТГ). В лунке планшета вносят исследуемый образец и конъюгат (Т4, конъюгированный с пероксидазой). Во время инкубации ТТГ (или ТГ) образца конкурирует с конъюгированным ТТГ (или ТГ) за связывание с антителами на поверхности лунки. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски обратно пропорциональ­на концентрации ТТГ (или ТГ) в исследуемом образце. Концентрацию ТТГ (или ТГ) в иссле­дуе­мых образцах определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания ТТГ (или ТГ) в калибровочных пробах.

Статистическая обработка результатов производилась в среде «Statistica 6.0 for Windows» по методу «ANOVA» с post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение по­лученных результатов до и после воздействия производилось по критерию Вилкоксона для не­пара­метрических данных, разброс данных на рисунках – стандартное отклонение.

Результаты 

В данных сериях исследований у двенадцатимесячных крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 543, 5 % и снижение уровней общих Т3 на 5, 3 % и Т4 на 6, 1 % (рис. 1, Б) по сравнению с их исходными уровнями (рис. 1, А). После двухнедельного воздействия СМД ХЭД1 10^-13 М подвергнутому УФИ у гипотиреоидных крыс в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 106, 3 %; повышение содержания общего Т3 на 3, 7 %; повышение содержания общего Т4 на 5, 4 % (рис. 1, В), по сравнению с животными с МГПТ, не получавших данной СМД ХЭД1 (рис. 1, Б).

В следующих сериях исследований у двенадцатимесячных крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 591, 2 % и снижение уровней общих Т3 на 5, 1 % и Т4 на 6, 8 % (рис. 2, Б) по сравнению с их исходными уровнями (рис. 2, А). После двухнедельного воздействия СМД ХЭД1 10^-17 М подвергнутому УФИ у гипотиреоидных крыс в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 100, 7 %; повышение содержания общего Т3 на 3, 1 %; повышение содержания общего Т4 на 5, 2 % (рис. 2, В), по сравнению с животными с МГПТ, не получавших данной СМД ХЭД1 (рис. 2, Б).

В следующих сериях исследований у двенадцатимесячных крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 603 % и снижение уровней общих Т3 на 4, 8 % и Т4 на 6, 2 % (рис. 3, Б) по сравнению с их исходными уровнями (рис. 3, А). После двухнедельного воздействия СМД ХЭД2 10^-13 М подвергнутому УФИ у гипотиреоидных крыс в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 117, 8 %; повышение содержания общего Т3 на 3, 9 %; повышение содержания общего Т4 на 4, 3 % (рис. 3, В), по сравнению с животными с МГПТ, не получавших данной СМД ХЭД2 (рис. 3, Б).

В следующих сериях исследований у двенадцатимесячных крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 597, 5 % и снижение уровней общих Т3 на 5, 5 % и Т4 на 6, 2 % (рис. 4, Б) по сравнению с их исходными уровнями (рис. 4, А). После двухнедельного воздействия СМД ХЭД2 10^-17 М подвергнутому УФИ у гипотиреоидных крыс в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 102, 2 %; повышение содержания общего Т3 на 3, 4 %; повышение содержания общего Т4 на 4, 6 % (рис. 4, В), по сравнению с животными с МГПТ, не получавших данной СМД ХЭД2 (рис. 4, Б).

Обсуждение

В лечении и реабилитации больных с различными болезнями большое место занимают лечебные физические факторы, как природные, так и получаемые искусственно. Лечебные физические факторы оказывают гомеостатическое влияние на различные органы и системы, способствуют повышению сопротивляемости организма к неблагоприятным воздействиям, усиливают его защитно-приспособительные механизмы, обладают выраженным лечебным действием, повышают эффективность других терапевтических средств и ослабляют побочные эффекты лекарств. Их применение доступно, высокоэффективно и экономически выгодно [21].

Очень важно понять, что УФ-физиотерапия является одним из важнейших компонентов всего комплекса физических методов лечения и реабилитации больных. Достоинство лечебных физических факторов в полной мере реализуется при их правильном применении и комбинировании с другими лечебно-профилактическими и реабилитационными мероприятиями [22].

Как было отмечено выше, механизм действия УФ-лучей основан на способности некоторых атомов и молекул избирательно поглощать энергию света. В результате этого молекулы тканей переходят в возбуждённое состояние, что запускает фотохимические процессы в чувствительных к УФ-лучам молекулах белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и РНК. Фотолиз белков эпидермальных клеток приводит к высвобождению биологически активных веществ (гистамина, ацетилхолина, простагландинов и др.), которые при поступлении в кровоток вызывают расширение сосудов, миграцию лейкоцитов [23]. Не меньшее значение имеют рефлекторные реакции, вызванные активацией многочисленных рецепторов продуктами фотолиза и биологически активными веществами, а также гуморальное воздействие на ЦНС, ЭC, иммунную и другие системы организма. Естественно, что УФ-излучение вызывает ответные реакции со стороны организма человека, которые и составляют основу физиологического и лечебного действия УФ-лучей. Одним из основных компонентов этого лечебного действия являются эффекты, связанные с формированием ультрафиолетовой (или фотохимической) эритемы. Максимальным эритемообразующим свойством обладает СУФ-излучение с длиной волны 297 нм. Широко используется бактерицидное действие УФ-облучения. Различают прямое и непрямое бактерицидное действие УФ-лучей. В результате прямого действия происходит коагуляция и денатурация белков микроорганизмов на поверхности раны, слизистой оболочке, что приводит к гибели бактериальной клетки. Непрямое действие УФ-излучения связано с изменением иммунобиологической реактивности организма под влиянием УФ-лучей [24].

УФ-лучи активно влияют на липидный, белковый и углеводный обмен. Под влиянием их субэритемных доз в коже из производных холестерина синтезируется витамин D3, контролирующий фосфорно-кальциевый обмен. Они снижают содержание атерогенного холестерина крови у больных атеросклерозом [25]. УФ-лучи в малых дозах улучшают процессы высшей нервной деятельности, улучшают мозговое кровообращение, влияют на тонус мозговых сосудов, повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды. Тонус вегетативной нервной системы изменяется в зависимости от дозы УФ-излучения: большие дозы уменьшают тонус симпатической системы, а малые – активируют симпатоадреналовую систему, корковый слой надпочечников, функцию гипофиза, ЩЖ. Благодаря своему многообразному действию, УФ-облучение (наряду с УВЧ-терапией и ультразвуковой терапией) нашло широкое применение для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний [26].

Анализируя влияние подвергнутых УФ-облучению СМД ХЭД1 и ХЭД2 10^-13 и 10^-17 М на изменение концентрации ТТГ у крыс с МГПТ в данной возрастной группе животных, можно отметить, что наибольший протекторный эффект от воздействия данных химических соединений наблюдается при использовании их СМД 10^-17 М с восстановлением показателей ТТГ и ТГ практически до нормы. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об оптимальной эффективности применения СМД 10^-17 М подвергнутой УФИ в восстановлении показателей концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у двенадцатимесячных гипотиреоидных крыс.

В настоящее время все более широкое распространение приобретают заболевания, связанные с угнетением функции ЩЖ.  Всестороннее изучение патогенеза этих заболеваний позволило разработать эффективные методы коррекции сопровождающих их метаболических расстройств, что внесло существенный вклад в разработку новых подходов к лечению [27]. Вместе с тем все еще существует целый ряд нерешённых проблем, связанных с ограниченными представлениями о молекулярных механизмах развития МГПТ [28]. Особый интерес в связи с этим представляет выяснение возрастных особенностей изменения регуляции функции ЩЖ при МГПТ. Всестороннее изучение этого вопроса открывает перспективы в разработке новых подходов к лечению осложнений МГПТ у разных возрастных групп животных [29].

Таким образом, при исследовании аспектов МГПТ: основная задача лечения – восстановление нормальных физиологических функций всех органов и систем, нарушенных вследствие МГПТ. Критерием адекватности лечения служит исчезновение клинических и лабораторных проявлений МГПТ [30]. 

Дефицит содержания общих и свободных тиреоидных гормонов (ТГ): трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) и тиреотропного гормона гипофиза (ТТГ) в сыворотке крови обуславливает появление клинического состояния, известного как гипотиреоз (ГПТ) [1]. В результате выраженного недостатка поступления йода и нарушения нормального функционирования многих систем организма, компенсаторные реакции не могут нормализовать функцию щитовидной железы (ЩЖ) [2]. В результате многочисленных исследований было установлено, что именно нарушение различных ферментных функций является основным фактором в патогенезе многих заболеваний живого организма [4]. В работе [3] отмечено, что эфирами и амидами холина осуществляется ряд важнейших функций в организме человека и животных.

Известно, что трипсин (ТРП) относятся к группе сериновых протеаз и содержат в активном центре остат­ки серина и гистидина. Применение ТРП в качестве лекарственного средства основано на его спо­собности разрушать некротизированные ткани, разжижать мокроту и другие вязкие сек­ре­ты, экссудаты, сгустки крови, а также на его противовоспалительном и противоотёчном дейст­вии и способности снижать резистентность гноеродной микрофлоры к действию антибио­тиков [5]. В данных сериях исследований использовался препарат кристаллический ТРП. По отношению к здоровым тканям ТРП неактивен и безопасен в связи с наличием в них его ингибиторов (специфического и неспецифических) [6].

Вместе с тем продолжают отсутствовать сведения относительно комбинированного применения  сверхмалых доз (СМД) эфиров холина, в частности, холинового эфира N-(2-метоксибензоил)-О- изопропил- α, β-дегидротирозина (ХЭ) и ТРП, в изучении особенностей изменения концентрации ТТГ и ТГ в сыворотке крови у крыс при МГПТ. В данном исследовании изучено комбинированное действие СМД ХЭ и ТРП (10^-13 и 10^-17 М) на изменение концентрации ТТГ,  свободных Т3 и Т4, в сыворотке крови у крыс посредством метода иммуноферментного анализа (ИФА).

Материал и методы

Исследования проведены на 110 двенадцатимесячных крысах-самцах (линия Вистар). СГПТ вызывался путём проведения тиреоидэктомии (ТЭК), согласно методике, указанной в наших предыдущей работе [7]. Животные были разделены на следующие 4 подопытные группы: 1) интактные животные – 20 экземпляров; 2) контрольные животные с МГПТ – 30 экземпляров; 3) животные с МГПТ, получавшие сочетанные внутримышечные инъекции ХЭ и ТРП в СМД 10^-13 М в течение 14 дней после ТЭК – 30 экземпляров; 4) животные с МГПТ, получавшие сочетанные внутримышечные инъекции ХЭ и ТРП в СМД 10^-17 М в течение 14 дней после ТЭК – 30 экземпляров.

В сыворотке крови с помощью метода ИФА определялась концентрация ТТГ и ТГ посредством иммуноферментного анализатора RISER 8793 по методике описанной в наших предыдущей статье [10]. Статистическая обработка результатов производилась с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены в относительных единицах (%). Значения группы контроля приняты за 100 %.

Результаты и обсуждение 

В данных сериях исследований у крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 647, 5 % и одновременное снижение уровня свободных Т3 – на 6, 8 % и Т4 – на 7, 2 %. После двухнедельного сочетанного воздействия СМД ХЭ и ТРП в СМД 10^-13 М у крыс с МГПТ в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 106, 1 %; содержание свободного Т3 повышалось на 5, 7 %; содержание же свободного Т4 повышалось на 6, 5 % по сравнению с животными с МГПТ, не получавших препаратов. В следующей серии исследований у крыс с МГПТ происходило повышение содержания уровня ТТГ в сыворотке крови на 655, 9 % и одновременное снижение уровня свободных Т3 – на 7, 6 % и Т4 – на 8, 1. После двухнедельного воздействия СМД ХЭ и ТРП 10^-17 М у крыс с МГПТ в сыворотке крови отмечалось: понижение содержания ТТГ до 96, 2 %; содержание свободного Т3 повышалось на 7, 7 %; содержание же свободного Т4 повышалось на 8, 4 % по сравнению с животными с МГПТ, не получавших препаратов. Можно отметить, что в данных сериях исследований действия СМД ХЭ 10^-13 М при СГПТ, наблюдается частичный эффект нормализации уровня ТТГ в сыворотке крови у гипотиреоидных крыс. Наибольшим протекторным эффектом в отношении вышеуказанных биохимических показателей обладают сочетанные СМД ХЭ и ТРП 10^-17 М (практически до нормы).

В основе развития синдрома ГПТ лежит длительный дефицит йодированных гормонов в организме со снижением окислительных процессов и термогенеза, что приводит к нарушениям центральной нервной системы, вегетативной нервной системы, эндокринной системы, сердечно-сосудистой системы, пищеварительной системы, а также к дистрофии и слизистому отёку различных органов и тканей (микседема). Микседематозный отёк представляет собой экстрацеллюлярное накопление кислых мукополисахаридов, резко увеличивающих гидрофильность тканей [9].

Проведенные исследования свидетельствуют о наличии протекторного эффекта от комбинированного применения СМД ХЭ и ТРП в сыворотке крови у крыс при МГПТ.  Полученные результаты согласуются с нашими предыдущими данными по исследованию воздействия СМД эфиров холина при ГПТ различной степени интенсивности [8, 10].