Методика. Материалом исследования служили геномная ДНК кур трех популяций воссоздаваемой Павловской породы кур из трех мест: экспериментальное хозяйство ФГБНУ ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург), экспериментальное хозяйство Московской области и фермерское хозяйство из Барнаула. Количество особей колебалось от 12 до 15.

Кровь кур брали из подкрыльцовой вены в микропробирки с ЭДТА для предотвращения свертывания. Геномную ДНК выделяли общепринятыми методами с применением протеиназы К, додецилсульфата натрия и фенола. Гибридизацию меченого дезоксигенином олигонуклеотидного зонда проводили по разработанной нами ранее методике. Детекция сигнала осуществлялась методом цветной реакции на щелочную фосфатазу. Компьютерная программа Gelstats™ позволяла рассчитать частоты встречаемости фрагментов ДНК и другие параметры в экспериментальных группах.

Ферментативное расщепление ДНК в количестве 10 мкг проводили ферментом BsuRI (Thermo Fisher Scientific™).  В пробирку помещали 90 мкл раствора ДНК, затем прибавляли 10 мкл 10´кратного буфера для рестриктазы BsuRI. Готовую реакционную смесь инкубировали при 37°С 3 часа. После расщепления,   фрагменты ДНК разделяли по размеру в электрофорезе с 0,8% агарозным гелем втечение 40 часов при напряжении 50В.

Гель затем  денатурировали 40 минут в щелочном растворе, содержащем 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCL, и нейтрализовали в растворе 0,5 М Трис и 1,5 М NaCL. Перенос одноцепочечной ДНК с геля на нейлоновый фильтр осуществляли под вакуумом 50 мбар в течении 1 часа в приборе для вакуумного переноса (GE Healthcare™).

Реакция молекулярной гибридизации проводили с меченым олигонуклеотидом (ГТГ)5 при температуре 45°С. Время гибридизации с олигонуклеотидом (ГТГ)5 составляло  30 минут.

Отмывание от не включившейся метки проводили на шейкере 2 раза по 15 минут при температуре 45°С. После этого фильтр инкубировали с блокирующим раствором и с конъюгированным антителом. Выявление мест локализации щелочной фосфатазы осуществляли по обычной методике с применением красителей: 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP) и нитро голубой тетразолий хлорид (NBT).

Определение генетической близости сравниваемых групп животных прово­дили на основе вычисления коэффициента сходства (BS), отражающим долю общих фрагментов ДНК между сравниваемыми группами особей на индивидуальных электрофоретических дорожках. Анализ внутрипопуляционной генетической вариабельности проводили на основании расчетов средней гетерози­готности по формулам [1, p. 733], а генетические расстояния рассчитывали по методике Lynch [5, p. 96].

Результаты. При проведении генетических исследований   на Павловской птице  из трех хозяйств, были получены  следующие  результаты (табл.1). Наибольшим коэффициентом сходства внутри породы отличались Павловские куры из Московской области (BS¹=0,58), а наименьшим – куры из экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (BS¹=0,39), но тем не менее  по генетическим расстояниям они очень близки (D=0,055). Наиболее выраженная генетическая дистанция определялась между  Павловскими курами из  Барнаула и Московской области  (D=0,105), а также  между курами из Барнаула и экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (D=0,100).

Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры в 3-х группах кур: Павловская (ВНИИГРЖ, Московская обл., Барнаул), рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5 и программой Gelstats™

P – вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором фрагментов ДНК

BS¹ – коэффициент сходства внутри групп

BS²  - коэффициент сходства между группами

D – генетическое расстояние по Lynch [5].

В результате проведенных исследований была определена гетерозиготность  в  группах Павловской птицы  из  трех хозяйств (табл.2).

Таблица 2 -  Гетерозиготность  в  3-х группах Павловских кур из экспериментального хозяйства ФГБНУ ВНИИГРЖ, Московской области и экспериментального хозяйства Барнаула

Н -  средняя гетерозиготность по Stephens [1].

Наиболее гетерогенной оказалась группа из экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (H=0,70), при этом она была более разнообразной внутри группы (BS=0,39). Наименьшая  гетерозиготность была у Павловских  кур из Московской области (D=0,48) и соответственно  коэффициент  сходства внутри группы был высоким (BS=0,58), птица разводилась в «себе», в то время  как, в экспериментальном хозяйстве ВНИИГРЖ велась работа по воссозданию уникальной птицы.

Полученные данные указывают на отдаленность Павловских кур полученных из Барнаула, от  кур  экспериментального хозяйства ГНУ ВНИИГРЖ  и  Московской области. Исходя из этих данных, можно предположить, что Павловские куры экспериментального хозяйства и куры из Московской области имеют общие генетические корни.

Заключение. Метод ДНК-фингерпринтинга позволил выявить особенности популяционной структуры трех генофондных популяций Павловской породы кур. Данные помгут лучше планировать селекционную работу с этими популяциями с целью полного воссоздания данной породы.