УДК 579.62: 579.253.4

РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОГО И БЫСТРОГО МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ КУР

Терлецкий Валерий Павлович1, Новикова Оксана Борисовна2
1Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики
2Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник отдела микробиологии

Аннотация
Использование эндонуклеаз рестрикции позволило предложить быстрый и эффективный метод генотипирования патогенных штаммов кишечной палочки. Метод использовали при выяснении путей распространения штаммов в условиях птицефабрик. Было показано отсутствие передачи возбудителя между отдельными птицефабриками и птичниками внутри птицефабрик.

Ключевые слова: генотипирование, ДНК фрагменты, птицефабрики, распространение патогенов, ферменты рестрикции


DEVELOPMENT OF EFFICIENT AND FAST IDENTIFICATION TECHNIQUE FOR PATHOGENIC STRAINS OF ESCHERICHIA COLI ISOLATED FROM VARIOUS CHICKEN ORGANS

Terletskiy Valery Pavlovich1, Novikova Oksana Borisovna2
1Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, D.Sc. in biology, senior researcher
2All Russian Veterinary Research Institute of Poultry Sciences, Cand. Sc. in veterinary medicine, senior researcher

Abstract
Use of restriction endonucleases allowed for setting up fast and efficient genotyping technique for E. coli pathogenic strains. The technique has been employed for elucidation of routes of transmission of strains in poultry farms settings. It was shown that there was no pathogen trans-mission between poultry farms and between hen houses within poultry farms.

Keywords: DNA fragments, genotyping, pathogen spread, poultry farms, restriction enzymes


Рубрика: Биология

Библиографическая ссылка на статью:
Терлецкий В.П., Новикова О.Б. Разработка эффективного и быстрого метода идентификации патогенных штаммов кишечной палочки, выделенной из различных органов кур // Исследования в области естественных наук. 2015. № 6 [Электронный ресурс]. URL: http://science.snauka.ru/2015/06/10143 (дата обращения: 26.01.2017).

Введение. В настоящее время циркулирование высокопатогенных видов бактерий на птицефабриках России находится под жёстким контролем ветеринарных служб. Очаги инфекции быстро локализуются и устраняется опасность распространения инфекции. В то же время, условно-патогенная микрофлора всё чаще вызывает заболевания у животных. К наиболее часто встречающимся этиологическим факторам инфекционных заболеваний относят кишечную палочку, которая наносит большой экономический урон птицеводству.

Актуальность исследований диктуется необходимостью быстро находить пути распространения, а также выявлять источники инфекции. Циркулирование возбудителей во внешней среде приводят к периодическим вспышкам заболеваний [1, c. 12]. В птицеводстве инфекционные заболевания, прежде всего колибактериоз, несут особую угрозу, так как на птицефабриках птица находится в условиях, благоприятствующих передаче микроорганизмов между особями (скученность содержания, запылённость помещений и т.д.). Кроме того, биологические особенности домашних кур современных промышленных кроссов предрасполагают к острому течению многих инфекционных заболеваний и существенному отходу птицы на птицефабриках и снижению рентабельности отрасли в целом. Использование современных методов генотипирования позволяет ответить на вопросы эпизоотологического плана, в частности, каким путём происходит передача возбудителя и где находится источник инфекции [2, c. 90; 3, p. 2].. Эти сведения необходимы для предотвращения новых вспышек болезни. Генотипирование используется также при определении эффективности вакцинопрофилактики при использовании живых вакцин (сравниваются генотипы выделенных изолятов бактерий у птицы с клиническими признаками болезни с генотипом вакцинного штамма).

Для надежной идентификации и паспортизации таких штаммов необходимо применение современных методик генотипирования микроорганизмов. Генотипирование позволяет присвоить молекулярно-генетический «штрих-код» каждому штамму, что крайне важно при использовании штаммов на практике, при решении спорных вопросов и при хранении коллекций штаммов в лабораторных условиях. Помимо этого, есть вероятность того, что определённый фрагмент ДНК может быть сцеплен с важной биологической или хозяйственно-полезной особенностью штамма, что позволит использовать его в качестве маркера данного свойства при изучении других потенциально полезных штаммов.

Существует множество методов типирования микроорганизмов. В настоящее время однозначно доказано, что методы, основанные на полиморфизме геномной ДНК (генотипирование), являются наиболее чувствительными и воспроизводимыми [4, 910; 3, p. 44].

На сегодня самым точным методом генотипирования является метод ДРИМ (двойное расщепление и избирательное мечение), который впервые был разработан для клинических изолятов патогенных микроорганизмов - Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Salmonella spp. [5, p. 284; 6, p. 417]. Результатом генотипирования методом ДРИМ является группа фрагментов ДНК в виде полос на фильтре, распределение которых специфично для каждого штамма или близкородственной группы штаммов [7, p. 140]. Точность идентификации штаммов, рассчитываемая по индексу дискриминации [8, p. 2466] превышает точность текущего «золотого стандарта» генотипирования (пульс-гель электрофорез) и достигает для псевдомонад 0,98, сальмонелл – 0,96.

В нашей работе была поставлена цель использовать идею двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) для разработки метода генотипирования кишечной палочки (Esherichia coli), вызывающей заболевания у сельскохозяйственной птицы Научная новизна предлагаемых исследований заключается в разработке методики генотипирования и её оптимизации под данный вид патогена.

Материалы и методы. Материалом исследования служила чистая культура бактериальных изолятов (29 образцов), выделенных из различных органов вынужденно убитых и павших кур кросса Хайсекс коричневый двух птицефабрик по производству яйца Центрального Федерального округа России. Источником микроорганизмов служили сердце, печень, лёгкие, селезёнка, яичные фолликулы, двенадцатиперстная и слепая кишки кур. Высевы на мясопептонный бульон делали из отдельных колоний, выращенных на чашках Петри на плотной питательной среде.

Генотипирование микроорганизмов предполагает выделение высокомолекулярной геномной ДНК. Все этапы этой процедуры изложены ниже:

- центрифугировать 1,5 мл суспензии клеток в жидкой питательной среде 8000 об/мин 5 минут, слить надосадочную жидкость;

- суспендировать осадок бактерий в 300µl буфера TES (50 mMTris-HCL -20 mMEDTA – 10mM NaCL, 8,0), внести 20 µl SDS (10% в воде), смешать, инкубировать при  37ºС 15 минут;

- внести равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, мешать 3 минуты, центрифугировать 10000 об/мин 10 минут;

- отобрать верхнюю фазу в другую пробирку;

- прибавить равный объем изопропилового спирта, смешать до выпадения ДНК в виде белых нитей или комка;

- центрифугировать, осадок ДНК промыть 70% этиловым спиртом;

- подсушить осадок ДНК и растворить в 50µl буфера ТЕ.

Метод генотипирования ДРИМ основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндонуклеазами, избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК с последующей их визуализацией. Для каждого вида микроорганизма подбирается пара эндонуклеаз, дающих оптимальное число и распределение фрагментов ДНК для количественного учета. В отношении E.coli оптимальным сочетанием является пара эндонуклеаз рестрикции XbaI/PstI Специфическое мечение достигается применением обычной ДНК-полимеразы (Taq-полимераза).

Реакция проводится в одной микропробирке, куда последовательно вносятся исследуемая ДНК, две эндонуклеазы, Taq-полимераза, биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio-dCTP). Инкубация проводится в течение 1-2 часов. Затем разделяем полученные фрагменты ДНК в обычном 0,8% агарозном геле. Сразу же после электрофореза в агарозном геле переносим ДНК на нейлоновый фильтр. Процесс длится 30-60 минут и проводится в дистиллированной воде. После этого фрагменты ДНК визуализируем в цветной реакции с применением конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза для выявления активности щелочной фосфатазы. Заключительный этап работы – это анализ распределения фрагментов ДНК и выявление идентичных генотипов в группе, близкородственных штаммов и генетически далеких друг от друга бактерий.

Результаты исследований. После испытания различных рестриктаз была определена оптимальная комбинация для последующего использования в генетической паспортизации штаммов E.coli – XbaI и PstI. Рестриктаза XbaI имеет 39 сайтов расщепления в геноме кишечной палочки. Рестриктаза PstI имеет около 1000 сайтов расщепления, что дает средний размер фрагмента ДНК 2000 пар оснований, что является оптимальным с точки зрения разделения ДНК в 0,8% агарозном геле. Указанные рестриктазы хорошо совместимы в одном буфере – буфер О (Сибэнзим), не проявляют «звездной» активности, стабильны, достаточно специфичны и не дороги.

Метод генотипирования ДРИМ для кишечной палочки разрабатывали на примере 29 изолятов микроорагнизмов. Изоляты выделяли из различных органов вынужденно убитых и павших кур, которые содержались в разных птичниках двух птицефабрик (табл. 1).

Таблица 1 ‒ Изоляты кишечной палочки, выделенные из разных органов кур в возрасте 300 дней породы Хайсекс коричневый на двух птицефабриках ЦФО России в 2013 г.

номер

изолята

орган

особь/птичник

птицефабрика

1 сердце

1/1

 

 

 

 

 

 

 

птицефабрика

№ 1

2 печень
3 легкие
4 яичные фолликулы
15 двенадцатиперстная кишка
16 слепая кишка
5 сердце

2/1

6 печень
7 яичный фолликул
8 сердце

3/1

9 печень
10 яичный фолликул
11 костный мозг
12 сердце

4/1

13 печень
14 яичный фолликул
17 двенадцатиперстная кишка
18 слепая кишка
19 сердце

1/4

 

 

 

птицефабрика

№ 2

20 двенадцатиперстная кишка
21 сердце

1/10

22 печень
23 сердце

1/13

24 печень
25 сердце

2/13

26 легкие
27 сердце

1/19

28 печень
29 яичный фолликул

По результатам генотипирования было выявлено 14 различных генотипов (табл. 2).

Таблица 2 ‒ Генотипы кишечной палочки, выделенной у кур породы Хайсекс коричневый из двух птицефабрик (птицефабрика № 1, номера изолятов с 1 по 18 и птицефабрика № 2 - номера с 19 по 29), выявленные методом ДРИМ в 2013 году

номера

генотипов

номера

идентичных изолятов

номера

близких изолятов

номера

далеких

изолятов

1

1; 2;3;4;6;7;8;10;11;12;13;14

2

5 (отличие на 3 фрагмента

от генотипа 1)

3

15 (отличие на 2 фрагмента

от генотипа 1)

4

16 (отличие на 3 фрагмента

от генотипа 1)

5

21;22

6

23;25;26

7

24 (отличие на 2 фрагмента

от генотипа 6)

8

28;29

9

27 (отличие на 2 фрагмента

от генотипа 8 )

10

9

11

17

12

18

13

19

14

20

Были выявлены группы идентичных штаммов, которые имели одинаковый профиль всех фрагментов ДНК. Самой большой группой идентичных штаммов оказались изоляты под номерами 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13 и 14, которые были обозначены как генотип 1. Другие генотипы включали 2-3 изолята либо были уникальными (1 изолят). Во многих случаях идентичные штаммы выделялись из органов одной и той же особи (например, изоляты 1, 2, 3 и 4). В отдельных случаях были выявлены близкородственные штаммы бактерий, отличающиеся друг от друга на 1-3 фрагмента ДНК. Эти штаммы бактерий были выращены из различных органов одной и той же особи. В данном случае можно говорить об инфицировании одновременно двумя штаммами, либо, что более вероятно, о возникновении мутации у бактерий, специализирующихся на размножении в отдельных органах курицы. Примером близкородственных штаммов выделенных из одной особи № 1 птичника 1 (таблица 1) являются изоляты 15 и 16, которые незначительно отличаются от большой группы идентичных изолятов (таблица 2). В то же время, можно говорить о независимом инфицировании особи двумя совершенно разными штаммами в случае особи № 3. Бактерии, выращенные из печени особи № 3 птичника 1 (изолят 9, генотип 10) сильно отличались от бактерий, выделенных из сердца (изолят 8, генотип 1), яичного фолликула (изолят 10, генотип 1) и костного мозга (изолят 11, генотип 1).

В ряде случаев были выявлены генотипы бактерий, значительно отличающиеся друг от друга и от кластеров идентичных изолятов. В частности, изоляты под номерами 9, 17, 18, 19, и 20 встречались только один раз (таблица 2). Результаты свидетельствуют о возможном перезаражении кур друг от друга. Особенно это проявляется у кур из одного птичника. В частности, один и тот же штамм циркулировал у особей №1 (изоляты 1, 2, 3 и 4), №2 (изоляты 6, 7), №3 (изоляты 8, 10 и 11) и №4 (изоляты 12, 13 и 14). Все особи содержались на птичнике 1. Полученные данные генотипирования изолятов кишечной палочки на примере птицефабрики № 2 указывают на отсутствие перезаражения кур, содержащихся в разных птичниках. Все штаммы от кур из разных птичников имели отличающиеся бактериальные генотипы. Данный факт свидетельствует об адекватности санитарных преград, предусмотренных между птичниками.

Обсуждение. При появлении любых несовпадений в распределении фрагментов ДНК у двух изучаемых образцов можно на 100% утверждать, что образцы относятся к двум генетически различным микробным штаммам. С другой стороны, если два образца не различаются, есть некоторая вероятность, что они все-таки различны. Не исключено, что другие методы анализа могут в каких-то случаях выявить разницу. Однако, данные на нескольких видах клинически значимых микроорганизмов (сальмонеллы, золотистый стафилококк, псевдомонады и клостридии) указывают, что метод ДРИМ самый высокочувствительный в плане выявления генетических различий между штаммами.

Метод ДРИМ основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндонуклеазами и избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК. Одна из рестриктаз при расщеплении ДНК образует ограниченное число фрагментов с так называемыми «липкими концами», которые включают метку (био-дЦТФ). В то же время, многочисленные фрагменты ДНК, образованные второй рестриктазой, дают только тупые концы, которые не включают метку. Такая избирательность мечения позволяет уменьшить число фрагментов ДНК с нескольких тысяч до нескольких десятков, и выявить это ограниченное число фрагментов на фильтре после их разделения по размеру в обычном агарозном геле. Преимуществом метода является быстрота (1 сутки в сравнении с 7 сутками метода пульс-гель электрофореза), высокая точность и отсутствие ПЦР этапа. В связи с тем, что у многих видов микроорганизмов геном к настоящему времени полностью секвенирован, т.е. определена последовательность нуклеотидов в геномной ДНК, есть возможность теоретически предсказывать количество фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении каждой из рестриктаз, а также после двойного расщепления одновременно двумя рестриктазами. Для этого мы используем доступную в интернете программу (http://insilico.ehu.es/DDSL). Программа была разработана исследователями из Испании [9, p. 799], которые также участвовали в разработке метода ДРИМ для клинически важных видов патогенных бактерий в рамках совместных грантов НАТО. В настоящее время метод ДРИМ используется в нескольких зарубежных клинических лабораториях (Швейцария, Германия, Испания).

Возможные пути использования метода генотипирования методом ДРИМ суммированы ниже:

- генетическая идентификация / паспортизация штаммов различных видов микроорганизмов, используемых в практике и научной деятельности;

- мониторинг способов распространения патогенов бактериальной природы (пути передачи, источники патогена);

- возможно выявление маркерных фрагментов ДНК, сцепленных с фенотипическими признаками микроорганизма;

Метод носит универсальный характер, так как может быть адаптирован практически к любому микроорганизму. В настоящее время доступно достаточное число рестриктаз, необходимых для подбора пары оптимальных ДРИМ ферментов для каждого вида микроорганизма.

Заключение. Был разработан эффективный и быстрый метод генотипирования кишечной палочки для использования в идентификации путей и источников распространения инфекции с целью более эффективного планирования профилактических санитарных мероприятий.


Библиографический список
  1. Добрина М. Н. Нужен постоянный контроль сальмонеллёза // Животноводство России. 2011. №3. С. 11‒13.
  2. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипическое и молекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. №6. С. 88‒93.
  3. Van Belkum. Guidelines for the validation and application of typing methods for the use in bacterial epidemiology // Clin. Microbial. Infect. 2007. V. 13. P. 1‒46.
  4. Lukinmaa, S., U-M. Nakari, M. Eklund, A. Siitonen.  Application of molecular genetic methods in diagnostics and epidemiology of food-borne bacterial pathogens // APMIS. 2004. V. 112. P.908‒929.
  5. Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomnas aeruginosa hospital isolates. Journal of Microbiological Methods. 2008. V. 72. P. 283‒287.
  6. Terletskiy V., Tyshchenko V., Martinez-Ballesteros I. et al. Validation of Double Digest Selective Label database for sequenced prokaryotic genomes. Bioinformatics. 2010. V. 26. P. 417‒418.
  7. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF) // Microbiol. Res. 2003. V.158. P. 135‒142.
  8. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity // Journal of Clinical Microbiology. 1988. V.26. P. 2465‒2466.
  9. Bikandi, J., R. San Millan, A. Rementeria, J. Garaizar. In silico analysis of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR, and endonuclease restriction // Bioinformatics. 2004. V.22. P. 798‒799.


Все статьи автора «tvi-57»


© Если вы обнаружили нарушение авторских или смежных прав, пожалуйста, незамедлительно сообщите нам об этом по электронной почте или через форму обратной связи.

Связь с автором (комментарии/рецензии к статье)

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться, чтобы оставить комментарий.

Если Вы еще не зарегистрированы на сайте, то Вам необходимо зарегистрироваться: