УДК 575.174.015.3

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОГО РАЗНООБРАЗИЯ В ГЕНОФОНДНОЙ ПАВЛОВСКОЙ ПОРОДЕ КУР

Тыщенко Валентина Ивановна
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики

Аннотация
Использованный ранее метод генотипирования генофондных пород и популяций кур оказался эффективным на трех популяциях кур восстанавливаемой генофондной Павловской породе. Были рассчитаны основные популяционные характеристики в изучаемых группах. Наиболее гомогенной оказалась популяция кур, содержавшихся в Московской области.

Ключевые слова: гетерозиготность, ДНК, куры, Павловская порода, ферменты рестрикции, фингерпринтинг


MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF INTRAPOPULATION VARIABILITY IN A GENE POOL PAVLOV CHICKEN BREED

Tyshchenko Valentina Ivanovna
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding
Cand.Sc in biology, senior researcher of the Laboratory of Molecular Cytogenetics

Abstract
The genotyping technique which has been used with gene pool chicken breeds proved to be quite effective in a gene pool Pavlov breed. Main population characteristics has been calculated in chicken populations. The most homogenous was chicken population from Moscow region.

Keywords: chicken, DNA, heterozygosity, Key words: Pavlov breed, restriction enzymes


Рубрика: Биология

Библиографическая ссылка на статью:
Тыщенко В.И. Молекулярно-генетический анализ внутрипопуляционного разнообразия в генофондной Павловской породе кур // Исследования в области естественных наук. 2015. № 6 [Электронный ресурс]. URL: http://science.snauka.ru/2015/06/10140 (дата обращения: 04.05.2017).

Введение. Павловская порода была выведена в 18 веке в селе Павлово Нижегородской губернии. Считается, что эта порода создавалась народной селекцией, но неповторимость облика этих кур свидетельствует о том, что порода – результат направленной  селекции. Поле революции 1917 года  остались считанные экземпляры Павловских кур. Работы по воссозданию  Павловской птицы были начаты в 80 –годы ХХ века в экспериментальном хозяйстве ВНИИГРЖ.  Были определены гены, контролирующие основные признаки генотипа Павловской породы. С учетом родственного происхождения и взаимного влияния друг на друга были подобраны породы Голландская белохохлая, Султанка, Падуан, Брабантер, Апенцеллер, Ля-Фреш, Гудан, Кревкер, Фавероль, при скрещивании которых можно получить кур с характерными признаками  Павловской породы. В настоящее время  воссоздана популяция этих кур с численностью  племенного ядра более 70 голов. Яйценоскость Павловских кур составляет 130-150 яиц в год. Живая масса петухов - 2,0-2,5 кг, а кур - 1,4-1,7 кг. Масса яиц небольшая и составляет всего 46-50 г. В связи с тем, что сейчас проводятся исследования с целью воссоздать оригинальную Павловскую породу и имеются несколько разрозненных популяций кур, приближающихся по характеристикам к желаемому фенотипу, стоит задача определить основные популяционно-генетические характеристики поголовья. Эти данные позволят лучше понять направление дальнейших работ по воссозданию породы со всеми присущими ей фенотипическими признаками. В последние годы методы молекулярной генетики хорошо зарекомендовали себя как надежный инструмент выявления особенностей генетической организации наследственного материала у животных [1, p.731]. Наряду с изучением микросателлитной ДНК [2, c. 21] другие полиморфные последовательности в геноме также являются объектом исследований. Например, минисателлитную ДНК можно применять при изучении генетического разнообразия в популяциях [3, с. 44; 4, с. 79].

Методика. Материалом исследования служили геномная ДНК кур трех популяций воссоздаваемой Павловской породы кур из трех мест: экспериментальное хозяйство ФГБНУ ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург), экспериментальное хозяйство Московской области и фермерское хозяйство из Барнаула. Количество особей колебалось от 12 до 15.

Кровь кур брали из подкрыльцовой вены в микропробирки с ЭДТА для предотвращения свертывания. Геномную ДНК выделяли общепринятыми методами с применением протеиназы К, додецилсульфата натрия и фенола. Гибридизацию меченого дезоксигенином олигонуклеотидного зонда проводили по разработанной нами ранее методике. Детекция сигнала осуществлялась методом цветной реакции на щелочную фосфатазу. Компьютерная программа Gelstats™ позволяла рассчитать частоты встречаемости фрагментов ДНК и другие параметры в экспериментальных группах.

Ферментативное расщепление ДНК в количестве 10 мкг проводили ферментом BsuRI (Thermo Fisher Scientific™).  В пробирку помещали 90 мкл раствора ДНК, затем прибавляли 10 мкл 10´кратного буфера для рестриктазы BsuRI. Готовую реакционную смесь инкубировали при 37°С 3 часа. После расщепления,   фрагменты ДНК разделяли по размеру в электрофорезе с 0,8% агарозным гелем втечение 40 часов при напряжении 50В.

Гель затем  денатурировали 40 минут в щелочном растворе, содержащем 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCL, и нейтрализовали в растворе 0,5 М Трис и 1,5 М NaCL. Перенос одноцепочечной ДНК с геля на нейлоновый фильтр осуществляли под вакуумом 50 мбар в течении 1 часа в приборе для вакуумного переноса (GE Healthcare™).

Реакция молекулярной гибридизации проводили с меченым олигонуклеотидом (ГТГ)5 при температуре 45°С. Время гибридизации с олигонуклеотидом (ГТГ)5 составляло  30 минут.

Отмывание от не включившейся метки проводили на шейкере 2 раза по 15 минут при температуре 45°С. После этого фильтр инкубировали с блокирующим раствором и с конъюгированным антителом. Выявление мест локализации щелочной фосфатазы осуществляли по обычной методике с применением красителей: 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP) и нитро голубой тетразолий хлорид (NBT).

Определение генетической близости сравниваемых групп животных прово­дили на основе вычисления коэффициента сходства (BS), отражающим долю общих фрагментов ДНК между сравниваемыми группами особей на индивидуальных электрофоретических дорожках. Анализ внутрипопуляционной генетической вариабельности проводили на основании расчетов средней гетерози­готности по формулам [1, p. 733], а генетические расстояния рассчитывали по методике Lynch [5, p. 96].

Результаты. При проведении генетических исследований   на Павловской птице  из трех хозяйств, были получены  следующие  результаты (табл.1). Наибольшим коэффициентом сходства внутри породы отличались Павловские куры из Московской области (BS1=0,58), а наименьшим – куры из экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (BS1=0,39), но тем не менее  по генетическим расстояниям они очень близки (D=0,055). Наиболее выраженная генетическая дистанция определялась между  Павловскими курами из  Барнаула и Московской области  (D=0,105), а также  между курами из Барнаула и экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (D=0,100).

Таблица 1 - Популяционно-генетические параметры в 3-х группах кур: Павловская (ВНИИГРЖ, Московская обл., Барнаул), рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга с зондом (ГТГ)5 и программой Gelstats™

Группы кур

n

Количество полос на дорожку

X±m

Р

BS1

BS2

D

Павловская экс.хоз-во

Павловская Моск. обл.

15

12

10,6±0,9

13,6±0,9

4,7х10-5

5,5х10-4

0,39

0,58

0,43

0,055

Павловская экс.х-во

Павловская экс. х-во Барнаул

15

13

10,6±0,9

15,0±1,4

4,7х10-5

7,5х10-5

0,39

0,53

0,36

0,100

Павловская Моск. обл.

Павловская экс. х-во Барнаул

12

13

13,6±0,9

15,0±1,4

5,5х10-4

7,5х10-5

0,58

0,53

0,45

0,105

P – вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором фрагментов ДНК

BS1 – коэффициент сходства внутри групп

BS2  - коэффициент сходства между группами

D – генетическое расстояние по Lynch [5].

В результате проведенных исследований была определена гетерозиготность  в  группах Павловской птицы  из  трех хозяйств (табл.2).

Таблица 2 -  Гетерозиготность  в  3-х группах Павловских кур из экспериментального хозяйства ФГБНУ ВНИИГРЖ, Московской области и экспериментального хозяйства Барнаула

Породы кур

n

Число локусов

Число аллелей

Число полиморфных локусов

H

 

Павловская экс. х-во

 

15

6,22

5,14

1,00

0,70

 

Павловская Моск обл.

 

12

9,20

3,59

0,78

0,48

Павловская экс. х-во Барнаул

13

9,62

3,53

0,90

0,56

Н -  средняя гетерозиготность по Stephens [1].

Наиболее гетерогенной оказалась группа из экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (H=0,70), при этом она была более разнообразной внутри группы (BS=0,39). Наименьшая  гетерозиготность была у Павловских  кур из Московской области (D=0,48) и соответственно  коэффициент  сходства внутри группы был высоким (BS=0,58), птица разводилась в «себе», в то время  как, в экспериментальном хозяйстве ВНИИГРЖ велась работа по воссозданию уникальной птицы.

Полученные данные указывают на отдаленность Павловских кур полученных из Барнаула, от  кур  экспериментального хозяйства ГНУ ВНИИГРЖ  и  Московской области. Исходя из этих данных, можно предположить, что Павловские куры экспериментального хозяйства и куры из Московской области имеют общие генетические корни.

Заключение. Метод ДНК-фингерпринтинга позволил выявить особенности популяционной структуры трех генофондных популяций Павловской породы кур. Данные помгут лучше планировать селекционную работу с этими популяциями с целью полного воссоздания данной породы.


Библиографический список
  1. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O’Brien S.J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. V.9. P. 729-743.
  2. Киселева Т.Ю., Подоба Б.Е., Заблудовский Е.Е., Терлецкий В.П., Воробьев Н.И., Kantanen J. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. 2010. №6. С.20-25
  3. Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Оценка генетического разнообразия в популяциях кур на основе геномной дактилоскопии  // Сельскохозяйственная биология. 2002. № 6. С. 43-46.
  4. Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Яковлев А.Ф. Использование метода фингерпринтинга ДНК для изучения генетической дивергенции в популяциях сельскохозяйственных животных // Вестник РАСХН. 2003. № 1. С. 79-80.
  5. Lynch M., Milligan B.G. Analysis of population structure with RAPD markers // Mol. Ecol. 1994. V. 3. pp. 91–99.


Все статьи автора «Терлецкий Валерий Павлович»


© Если вы обнаружили нарушение авторских или смежных прав, пожалуйста, незамедлительно сообщите нам об этом по электронной почте или через форму обратной связи.

Связь с автором (комментарии/рецензии к статье)

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться, чтобы оставить комментарий.

Если Вы еще не зарегистрированы на сайте, то Вам необходимо зарегистрироваться: