УДК 581. 131: 632.9
Гуляева А.Б., Богдан М.М.
Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины
03022, Киев, ул. Васильковская, 31/17
В статье описаны результаты исследования содержания сульфгидрильных групп в корнях 14-дневных проростков озимой пшеницы под действием минерального удобрения и фунгицида.
Установлено, что обработка фунгицидом в комбинации с содержанием 0,12 мМ ортофосфата в питательном растворе способствует увеличению содержания SH- групп в тканях корня на 29 %.
Установлено, что обработка растений озимой пшеницы сорта Смуглянка минеральным удобрением Herbagreen в концентрации 0,2 % приводит к увеличению содержания SH-групп в тканях корней озимой пшеницы на 17 %, а при повышении концентрации удобрения до 0,5 % содержание сульфгидрильных групп имеет тенденцию к снижению, что возможно вызвано связыванием свободных сульфгидрильных групп и образованием меркаптидов.
Введение.
Одним из способов повышения урожайности считается оптимизация баланса питательных элементов и борьба с фитопатогенами, что позволяет ограничить токсическое действие фитопатогенной микрофлоры на агроценоз и таким образом улучшит урожай и его качество [2 - 6].
В качестве оценки влияния некорневой обработки удобрением и фунгицидом на ферментативную активность корневой системы мы выбрали методику, позволяющую исследовать содержания сульфгидрильных групп в тканях корня [9].
Многочисленными исследованиями была доказана высокая реакционная способность сульфгидрильных групп (СГ), их способность легко окислятся, легко вступать в реакции алкилирования, ацилирования, тиол-дисульфидного обмена. Известно, так же, что в реакции с ионами тяжёлых металлов они способны образовывать меркаптиды, а в реакции с альдегидами и кетонами меркаптали и меркаптолы. Важна роль сульфгидрильных групп в биохимических процессах, в реакциях образования и переноса ацильных остатков, связанных с метаболизмом липидов и углеводов (СГ кофермента А, липоевой кислоты и 41-фосфопантетеина), в обезвреживании чужеродных органических соединений (СГ глутатиона), а так же в восстановлении перекисей и в осуществлении их коферментных функций. В белках СГ входят в состав остатков аминокислоты цистеина; в состав активных центров ряда ферментов СГ участвуют в их каталитическом действии, в связывании субстратов, коферментов и ионов металлов. Каталитическая роль СГ ферментов заключается в образовании промежуточных соединений с субстратами (или их остатками) или в переносе электронов и протонов от субстратов к акцепторам (в некоторых окислительных ферментах) [1, 7 -11 ].
Блокирование СГ при помощи специфичных реагентов вызывает частичное или полное торможение активности многих ферментов. Дисульфидные связи (-S-S-) играют важную роль в стабилизации структуры белков, в том числе ферментов, антител и некоторых гормонов, которые образуются при окислении СГ в процессе биосинтеза белков. Расщепление дисульфидных связей приводит к нарушению нативной структуры белков и утрате ими биологической активности [7].
Таким образом, целью нашего исповедования было проследить взаимосвязь между некорневой обработкой минеральным удобрением Herbagreen, а так же химической защиты с использованием фунгицида на содержание в корнях проростков озимой пшеницы сульфгидрильных SH- групп.
Методика.
Растения озимой пшеницы высокоинтенсивного типа сорт Смуглянка выращивали лабораторным методом в водной культуре. В качестве питательной смеси использовали ½ среды Хогланда-Арнона при температуре 25̊ С/20̊ С день / ночь в контролируемых условиях освещения при 16-часовом фотопериоде, освещенные на уровне проростков 400 Вт/м2 и относительной влажности воздуха 65-70 %. Обработка 14-дневных проростков проводилась по двум разным схемам:
І. 1.Контроль ½ Х-А (0,12 мМоль/л Р);
2. ½ Х-А +1/4 Р(0,06 мМоль/л Р);
3. ½ Х-А (0,12 мМоль/л Р)+ обработка 10-3М Амистар Экстра 280 SC; 4. ½ Х-А +1/4 Р (0,06 мМоль/л Р) + обработка 10-3М Амистар Екстра 280 SC.
ІІ. 1.Контроль: ½ Х-А;
2. ½ Х-А+ обработка Herbagreen 0,2 %;
3. ½ Х-А + обработка Herbagreen 0,5 %.
В состав минерального удобрения Herbagreen входят: CaO – 35,9 %; MgO – 1,9 %; SiO2 – 18,1 %; P2O5 – 0,28 %; K2O – 0,1 %; S – 0,52 %. Биологическая, как и аналитическая повторность опыта была четырехкратной.
Проростки озимой пшеницы сорта Смуглянка, выращены в одинаковых условиях были использованы для определения количества реактивных сульфгидрильных групп в корнях 14-дневных проростков по методике Велча и Норвела (1993). Данная методика основана на использовании Реактива Элмана. Реактив Элмана или 5,5-дитиобис (2-нитробензойная кислота) (DTNB) может вступать в реакцию с SH-группами белков и пептидов. Образованный в результате 5-тио-2-нитробензойный анион имеет интенсивный желтый цвет. На этом базируется количественное определение SH-групп в растворимых и высокомолекулярных соединениях клеток. Раствор, который содержал 0,2 М Tris-HCl и 0,02 М Na-EDTA (pH 8,2), переносили в аликвоту объёмом 50 мл и в течение 10 мин продували аргоном, перед прибавлением 1мл 5,5-дитио-би-2 нитробензойная кислота (DTNB). В результате, концентрация полученного раствора содержала 2 мМ DTNB не проникает через клеточную мембрану и реагирует с сульфгидрильными группами на внешней поверхности плазматической мембраны в форме анионов нитромеркаптобензоной кислоты, которая имеет интенсивную желтую окраску и может быть измерена спектрофотометрическим методом. Корни 4-х целых растений были погружены в приготовленный раствор и через 15 мин, свободные сульфгидрильные группы определялись в аликвотных растворах при длине волны 412 нм, на спектрофотометре СФ-26, аргон газообразный продувался через раствор в течение всего времени. Калибровочную кривую строили по разным концентрациям глутотиона [11].
Обработка результатов производилось с использованием компьютерных программ (Microsoft Excel).
Результаты и обсуждение.
Обработка проростков озимой пшеницы сорта Смуглянка фунгицидом Амистар Экстра 280 SC привела к увеличению в корнях содержания сульфгидрильных SH- групп, в зависимости от содержания фосфора в питательном растворе (рис. 1). Обработка фунгицидом при содержании в питательной среде 0,12 мМ KH2PO4 приводила к увеличению содержания SH- групп в тканях корня на 29 %. При двукратном снижении содержания фосфора (0,06 мМоль/л) при обработке фунгицидом, содержание сульфгидрильных групп было на уровне контроля, что может свидетельствовать о том, что вещества, входящие в состав фунгицида- ципроканозол и азоксистробин могут действовать на ферментативную активность корня лишь при достаточном обеспечении фосфором.
Рис.1. Влияние обработки фунгицидом и содержания фосфора в растворе на содержание SH–групп в тканях корней озимой пшеницы.
Варианты: 1.Контроль ½ Х-А (0,12 мМоль/л Р); 2. ½ Х-А +1/4 Р(0,06 мМоль/л Р); 3. ½ Х-А (0,12 мМоль/л Р)+ обработка фунгицидом; 4. ½ Х-А +1/4 Р (0,06 мМоль/л Р) + обработка фунгицидом.
Исследование влияния внекорневой обработки минеральным удобрением HERBAGREEN, в состав которого входит Ca, Mg, Si, P2O5, K2O и S показало отсутствие прямой зависимости от его концентрации (рис. 2). С увеличением концентрации удобрения содержание SH-групп в тканях корней озимой пшеницы сорта Смуглянка: при 0,2 %-й концентрации повышалось – на 17 %, а при 0,5 % оставалось на уровне контроля и даже имело тенденцию к снижению. Отсутствие значительного эффекта в данном случае может объясняться высоким сродством ионов двухвалентных металлов к SH-группам. Ионы металлов легко реагируют как с RS-ионами, так и с неионизированными SH-группами в сторону образования слабодиссоциирующих меркаптидов [7], а поскольку методика Велча и Норвела рассчитана на определение свободных сульфгидрильных групп, их количество, скорее всего, снизилось в результате такого реагирования.
Рис.2. Влияние внекорневой обработки минеральным удобрением Herbagreen на содержание SH-групп в тканях корней озимой пшеницы.
Варианты: 1 – Контроль: ½ Х-А, 2 – ½ Х-А + обработка Herbagreen 0,2% , 3 – ½ Х-А + обработка Herbagreen 0,5 %.
Таким образом, обработка фунгицидом в комбинации с содержанием 0,12 мМ ортофосфата в питательном растворе способствует увеличению содержания в тканях корня сульфгидрильных групп на 29 %.
Обработка растений озимой пшеницы сорта Смуглянка минеральным удобрением Herbagreen приводит к увеличению содержания SH-групп в тканях корней озимой пшеницы сорта Смуглянка: при 0,2 %-й концентрации – на 17 %, с увеличением концентрации удобрения до 0,5 % содержание сульфгидрильных групп имеет тенденцию к снижению. Предположительно, эффект снижения может быть вызван связыванием свободных сульфгидрильных групп с образованием меркаптидов.
Литература.
1. Биологический энциклопедический словарь// гл. ред. М. С. Гиляров; Редкол.: А. А. Бабаев, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин и др. — 2-е изд., исправл. — М.: Сов. Энциклопедия, 1986.
2. Душкин А.Н., Беспалова Н.С. Комплексное действие удобрений, микроэлементов и регуляторов роста // Химизация сельского хозяйства.-1990, №6.- С. 59-61.
3. Минеев, В.Г. Агрохимия: учебник. 3-е издание / В.Г. Минеев // М.: издательство Московского университета; Наука, 2006. — 720 с.
4. Минеев, В.Г. Плодородие и биологическая активность дерново-подзолистой почвы при длительном применении удобрений и их последействии / В.Г. Минеев, Н.Ф. Гомонова, М.Ф. Овчинникова // Агрохимимия. 2004 – №7. – С. 5-10.
5. Пахненко Е.П. Роль почвы и удобрений в устойчивости растений к патогенным грибам в агроценозе: Автореф. дис. д-ра биол. наук / Е.П.Пахненко. М., 2001 —49 с.
6. Ринькис Г.Я., Рамане Х.К., Паэгле Г.В. Основы оптимизации минерального питания растений // Макро- и микроэлементы в минеральном питании растений.- Рига, ЗИНАТНЕ, 1979.- С. 29-83.
7. Торчинский Ю. М., Сульфгидрильные и дисульфндные группы белков, М., 1971.
8. Jocelyn P.C. Biochemistry of the SH-groups. The occurence, chemical properties, metabolism and biolog ical function of thiols and disulphides. London- New York: Acad. Press. – 1972. – 404 p.
9. Jocelyn P.C. Spectrophotometric assay of thiols. Methods Enzymol. – 1987. – 143. – 4467 p.
10. Friedman M., The chemistry and biochemistry of the sulfhydryl group in amino acids, peptides and proteins, Oxf.- N. Y., 1973.
11. Rengel Z. Sulfhydryl groups in root-cell plasma membranes of wheat genetypes differing in Zn efficiency // Physiologia Plantarum. – 1995. – 4. – p. 604-612.